Lysosomal

Apr 13, 2023

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2654 (2023) Citer cet article

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La stéatohépatite non alcoolique (NASH) a reçu une grande attention en raison de sa forte incidence. Ici, nous montrons que la protéine transmembranaire associée au lysosomal 5 (LAPTM5) est associée à la progression de la NASH grâce à une analyse bioinformatique approfondie. Le niveau de protéine de LAPTM5 porte une corrélation négative avec le score NAS. De plus, la dégradation de LAPTM5 est médiée par sa modification d'ubiquitination par l'E3 ubquitine ligase NEDD4L. Découverte par des expériences menées sur des souris mâles, la déplétion spécifique des hépatocytes en Laptm5 exacerbe les symptômes de la NASH chez la souris. En revanche, la surexpression de Laptm5 dans les hépatocytes exerce des effets diamétralement opposés. Mécaniquement, LAPTM5 interagit avec CDC42 et favorise sa dégradation de manière dépendante des lysosomes sous la stimulation de l'acide palmitique, inhibant ainsi l'activation de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes. Enfin, la surexpression hépatique de Laptm5 médiée par l'adénovirus améliore les symptômes susmentionnés dans les modèles NASH.

La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est pathologiquement caractérisée par une stéatose hépatique, un ballonnement des hépatocytes, une inflammation lobulaire et hépatique et une fibrose interstitielle1,2. En tant que principale cause responsable de la progression de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire (CHC), la NASH représente une personne sur cinq atteinte de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et on estime qu'elle affecte environ 25 % de la population adulte mondiale selon de récentes rapports3,4. Malheureusement, les mesures thérapeutiques efficaces pour se protéger contre le développement et la progression de la NASH restent limitées, et jusqu'à présent, aucune thérapie pharmacologique approuvée par la FDA n'a été disponible5,6. Les cibles moléculaires de la NASH attirent de plus en plus l'attention en raison de leurs bonnes perspectives d'application thérapeutique7.

Ces dernières années, le rôle de la régulation liée aux lysosomes dans la progression de la maladie a fait l'objet d'études actives. En fait, les lysosomes auraient non seulement pour fonction de dégrader et de recycler les déchets cellulaires, mais seraient également des organites clés impliqués dans la dégradation des protéines, la détection des nutriments, l'immunité innée et adaptative8,9. Et jusqu'à présent, il a été prouvé que les lysosomes interagissent avec de multiples voies de signalisation et régulent la progression d'un certain nombre de maladies, telles que l'athérosclérose, les maladies de neurodégénérescence, les troubles auto-immuns et les troubles de stockage lysosomal. Pendant ce temps, la dégradation des protéines modulée par le système de protéostase est considérée comme une plate-forme attrayante pour le ciblage des médicaments et joue un rôle important dans un large éventail d'activités physiologiques humaines10,11.

La famille LAPTM, qui comprend LAPTM4A, LAPTM4B et LAPTM5, a fait l'objet d'études approfondies ces dernières années en raison de leur rôle dans le transport des protéines et la dégradation des lysosomes et peut servir de cible particulière pour l'intervention contre la maladie. La protéine transmembranaire associée au lysosomal 5 (LAPTM5) appartient à la famille des protéines transmembranaires endosomales/lysosomales tardives12 et a été initialement identifiée comme un régulateur de l'homéostasie des protéines13,14 et un modulateur des voies de signalisation inflammatoires15. LAPTM5 améliore l'hypertrophie cardiaque en modulant l'activité de la voie de signalisation MAPK16. Nos recherches précédentes17,18 et des études menées par d'autres chercheurs19,20 ont montré que l'activation de la voie de signalisation MAPK était intimement liée au développement et à la progression de la NASH. Basée sur quelques résultats préliminaires, cette étude a été menée sur l'hypothèse que LAPTM5 est impliqué dans la progression de la NASH.

Dans cette étude, nous avons démontré que l'expression protéique de LAPTM5 était significativement régulée à la baisse dans le foie des sujets NASH humains et des modèles NASH murins. L'épuisement de LAPTM5 dans les hépatocytes a considérablement exacerbé la stéatose, l'inflammation et la fibrose hépatiques dans les modèles NASH de souris induits par un régime alimentaire riche en graisses et en cholestérol (HFHC), tandis que la surexpression de LAPTM5 dans les hépatocytes a considérablement retardé et atténué les changements pathologiques précédents. Nous avons en outre découvert que LAPTM5 pouvait interagir directement avec la protéine Cell Division Cycle 42 (CDC42) et que la surexpression de LAPTM5 favorisait sa dégradation lysosomale dans les circonstances de la stimulation de l'acide palmitique. D'autre part, l'expression de CDC42 était significativement régulée à la hausse lorsque l'expression de LAPTM5 était diminuée, ce qui a été confirmé dans les tissus NASH murins et humains. En conséquence, l'effet protecteur de LAPTM5 sur le dépôt et le métabolisme des lipides dans les hépatocytes et l'inhibition de l'activation de la voie de signalisation MAPK pourraient être significativement abolis par la surexpression de CDC42. De plus, le dépôt de lipides hépatocytaires dû à l'inactivation de LAPTM5 a été significativement supprimé par l'inactivation de CDC42, ce qui suggère que LAPTM5 régule la progression de la NASH en modulant l'expression protéique de CDC42 pour médier l'activité de la voie de signalisation MAPK. La thérapie médiée par l'adénovirus pourrait également améliorer considérablement les symptômes de la NASH. Ensemble, ces résultats ont révélé que, d'un point de vue mécanique, LAPTM5 agit comme un régulateur de la progression de la NASH et, cliniquement, il pourrait également servir d'indicateur de la progression de la NASH et de cible pour le traitement de la NASH.

Alors que la NASH est pathophysiologiquement compliquée et multifactorielle, un grand nombre de protéines se sont avérées impliquées dans la régulation de la NASH. Pour savoir quelles protéines sont les déterminants les plus critiques dans la pathogenèse de la NASH, nous avons recherché 10 bases de données cliniques d'ARN-Seq à partir d'échantillons de foie de sujets NASH et avons récupéré trois protéines conservées, présentes dans les lysosomes, certains granules et la lumière granulaire azurophile, qui sont inclus dans toutes les 10 bases de données cliniques (Fig. 1a–c). Il convient de noter que la gravité de la maladie est le plus étroitement corrélée à l'expression de protéines localisées dans le lysosome (Fig. 1d). Les résultats de la recherche dans 5 bases de données d'ARN-Seq de foies de souris ont également confirmé cette conclusion (Fig. 1e). Compte tenu du rôle important des protéines transmembranaires dans la progression de la maladie21,22,23, 71 protéines transmembranaires ont été identifiées parmi les protéines associées lysosomales ci-dessus. Une analyse de criblage à haute teneur a été réalisée pour évaluer l'effet de ces gènes sur les profils lipidiques et les résultats ont montré que LAPTM5 avait l'effet inhibiteur le plus fort sur l'accumulation de lipides dans les hépatocytes lors de la stimulation de l'AP (Fig. 1f). Pour étudier la corrélation entre LAPTM5 et NASH, nous avons d'abord déterminé l'expression protéique de LAPTM5 dans le foie de sujets humains sans stéatose ou avec NASH, les niveaux de protéine hépatique LAPTM5 se sont avérés significativement régulés à la baisse chez les patients NASH que chez leurs patients non atteints. - Homologues NASH (Fig. 1g et Supplémentaire Fig. 1a, b). En combinaison avec les résultats de l'immunohistochimie, nous avons constaté que les niveaux de protéines de LAPTM5 étaient négativement corrélés au score NAS (Fig. 1h, i). Conformément à notre observation chez l'homme, l'expression de la protéine LAPTM5 était significativement diminuée dans le foie des souris ob/ob et des souris de type sauvage suivant un régime riche en graisses (HFD), un régime riche en graisses et en cholestérol (HFHC) ou de la méthionine et régime déficient en choline (MCD) (Fig. 1j et Supplémentaire Fig. 1c – e). De plus, des expériences in vitro ont démontré que l'expression de la protéine LAPTM5 était considérablement réduite de manière dépendante du temps dans les hépatocytes humains L02 et les hépatocytes primaires de souris après traitement par PA (Fig. 1f, g supplémentaires). Par la suite, l'expression génique de Laptm5 dans la NASH ou non-NASH a été détectée par la qPCR et le résultat a montré, de manière inattendue, que les niveaux d'ARNm de Laptm5 étaient comparables dans les modèles in vivo et in vitro, indiquant que LAPTM5 était régulé post-transcriptionnellement dans réponse à la stimulation métabolique (Fig. 1h-j supplémentaire). Collectivement, la corrélation négative frappante entre l'expression de LAPTM5 et le développement de la NASH suggère que LAPTM5 joue un rôle dans la progression retardée de la maladie.

a Le GSE dérivé de l'ARN-seq de foies humains de patients cliniques NASH et de patients en bonne santé ou obèses en bonne santé. Les catégories de gènes partagées entre ≥ 10 données GSE sont indiquées par des points noirs. L'histogramme au-dessus de chaque graphique indique les temps des catégories de gènes activés dans chaque catégorie. b Le graphique circulaire a montré la représentation statistique des catégories de gènes partagées GSE. Les nombres entiers entre parenthèses représentent les catégories de gènes et les parenthèses hors parenthèses représentent le nombre de GSE partagés. c Diagramme de points NES de 3 catégories de gènes conservés dans 10 bases de données humaines. d Analyse du score GSVA de ces 3 gènes conservés dans les bases de données. e Analyse NES de 5 bases de données de foies de souris. f Analyse quantitative de l'intensité de la fluorescence rouge du Nil des cellules L02 avec 71 surexpressions moléculaires (n = 3 expériences indépendantes). g Analyse Western blot représentative (gauche) et quantification (droite) des niveaux de protéine LAPTM5 dans les foies humains de NASH (n = 20 personnes) ou d'un groupe non NASH (n = 16 personnes). h Coloration immunohistochimique de LAPTM5 dans des coupes de foie d'humains dans les groupes indiqués (n = 5 personnes/groupe). Barre d'échelle, 50 μm. i Analyse de corrélation entre les niveaux de protéine LAPTM5 (normalisés au niveau de β-actine) et NAS (r2 = 0,6964, p < 0,0001), (n = 36 personnes). j Niveaux représentatifs de protéines LAPTM5 dans les foies provenant d'un régime alimentaire normal et de souris nourries au régime HFHC (n = 6 souris/groupe). Pour (d), les données sont présentées sous forme de diagrammes à moustaches : ligne médiane, médiane ; boîte, 25–75e centile ; moustache, valeurs minimales à maximales ; Pour f, g, j, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD et le test t de Student bilatéral a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Explorer davantage le mécanisme sous-jacent à la régulation à la baisse de la protéine LAPTM5 dans la NASH. Il a été rapporté que les protéines intracellulaires pouvaient être dégradées par le système ubiquitine-protéasome ou la voie de l'autophagie24, les inhibiteurs des différentes voies ont été traités dans des hépatocytes stimulés avec de l'acide palmitique (PA) et la dégradation des protéines de LAPTM5 a été sauvée par l'inhibiteur du protéasome MG132 , tandis que l'inhibiteur de lysosome Chlq n'a joué aucun rôle dans le sauvetage. (Fig. 2a, b). Ensuite, les protéines susceptibles de participer à la dégradation de LAPTM5 ont été détectées par spectrométrie de masse IP et NEDD4L, NEDD4, WWP2 et ITCH se sont avérés convenir (Fig. 2c). Le résultat de la spectrométrie de masse a été vérifié par le test CO-IP et NEDD4L a montré la plus forte interaction avec LAPTM5 (Fig. 2d). Pendant ce temps, la surexpression de NEDD4L a eu l'effet promoteur le plus fort sur la dégradation de LAPTM5 (Fig. 2e), ce qui suggère que NEDD4L est un régulateur majeur de la dégradation de la protéine LAPTM5. Ensuite, l'interaction entre LAPTM5 et NEDD4L a été confirmée in vitro par des tests de précipitation CO-IP et GST (Fig. 2f, g). Afin de mieux comprendre le mécanisme de NEDD4L médiant la dégradation de LAPTM5, des tests IP ont été effectués pour examiner l'ubiquitination de LAPTM5. Alors que l'ubiquitination de LAPTM5 était significativement améliorée lorsque NEDD4L était surexprimé, cette modification était bloquée après l'inactivation de NEDD4L (Fig. 2h, i). Nos résultats ont indiqué que la dégradation de LAPTM5 était médiée par NEDD4L via l'ubiquitination liée à K48 (Fig. 2j, k). De plus, nous avons prouvé que la dégradation était favorisée par la ligase E3 de NEDD4L (Fig. 2l). Et de plus, le renversement de NEDD4L a sauvé avec succès la dégradation de LAPTM5 (Fig. 2m). De plus, nous avons constaté que les niveaux de protéines de NEDD4L étaient significativement régulés à la hausse dans le groupe NASH par rapport au groupe témoin, ce qui a été vérifié chez les sujets NASH humains, les modèles NASH de souris et les hépatocytes stimulés par l'AP (Fig. 2a – e supplémentaire). . Les résultats ont prouvé que NEDD4L était également régulé par NASH.

a et b Images Western blot des niveaux de protéine LAPTM5 dans les hépatocytes de souris ( a ) et les hépatocytes L02 ( b ) traités avec MG132 (50 μM), Chlq (50 μM) ou DMSO. c Procédure d'identification des ligases d'ubiquitine E3 interagissant avec LAPTM5 par analyse IP-MS. d Interaction entre LAPTM5 et NEDD4L, NEDD4, ITCH, WWP2 dans les cellules L02. Le Western blot montre l'expression de LAPTM5 après transfection avec les plasmides indiqués. f et g Co-IP (f) et GST pull-down (g) montrent l'interaction entre LAPTM5 et NEDD4L. h Les résultats de Co-IP montrent l'effet de NEDD4L sur l'ubiquitination de LAPTM5 après traitement au MG132 (25 μM). i Tests Co-IP de l'ubiquitination de LAPTM5 après différents traitements. j Dépistage d'ubiquitination de LAPTM5 par NEDD4L avec les types d'ubiquitine indiqués. ( k ) Ubiquitination de LAPTM5 dans des hépatocytes L02 transfectés avec les plasmides indiqués. l Niveaux de protéine LAPTM5 dans les cellules L02 transfectées avec les plasmides indiqués. m Les résultats du transfert Western de l'expression de LAPTM5 changent après l'inactivation de NEDD4L dans les hépatocytes primaires. Les immunotransferts sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour étudier l'effet de LAPTM5 sur le métabolisme des lipides et l'inflammation dans les hépatocytes, nous avons isolé des hépatocytes primaires de souris knock-out Laptm5 (Laptm5-KO) et de souris témoins Laptm5-Flox, avec des hépatocytes primaires infectés par un plasmide à médiation vectorielle adénovirale surexprimant Laptm5 (AdLaptm5 -Drapeau) (Fig. 3a et Fig. 3a supplémentaire). La coloration au rouge du Nil (Fig. 3b et Fig. 3b supplémentaire) a révélé que l'accumulation de lipides hépatocytaires induite par le PAOA dans le groupe Laptm5-KO s'était manifestement détériorée par rapport au groupe témoin et s'accompagnait de concentrations élevées de triglycérides (TG) et de cholestérol total (TC) (Fig. 3b, c). En revanche, la surexpression de Laptm5 dans les hépatocytes a amélioré le dépôt de lipides induit par le PAOA (Fig. 3b, c supplémentaires). Et aucune différence significative dans le dépôt de lipides des hépatocytes n'a été observée dans les groupes traités à la BSA. De plus, les effets inhibiteurs de LAPTM5 sur le métabolisme des lipides et l'inflammation ont été confirmés par qPCR et Western blot (Fig. 3d – g et Supplémentaire Fig. 3d – g). De plus, sur la base de nos données RNA-seq, l'analyse de regroupement hiérarchique a clairement classé les échantillons traités au PAOA en deux sous-groupes : Laptm5-Flox-PAOA et Laptm5-KO-PAOA (Fig. 3h). Il convient de noter que le knock-out de Laptm5 a induit les processus biologiques liés au métabolisme des lipides et à l'inflammation (Fig. 3i – k). Dans l'ensemble, ces preuves in vitro suggèrent que LAPTM5 exerce un effet protecteur sur l'accumulation de lipides induite par le stress métabolique et l'inflammation dans les hépatocytes.

a Niveaux de protéine LAPTM5 dans les hépatocytes isolés de souris Laptm5 knock-out (KO) ou de souris WT (n = 3 souris/groupe). b et c Coloration au rouge du Nil (b) et teneur en TG, TC (c) dans les hépatocytes primaires après les stimulations indiquées. Barre d'échelle, 25 μm, (n = 3 expériences indépendantes). d et e Niveaux relatifs d'ARNm (n = 4 souris/groupe) (d) et de protéines (n = 3 souris/groupe) (e) de marqueurs liés au métabolisme des acides gras dans les groupes indiqués. f et g Niveaux relatifs d'ARNm (n = 4 souris/groupe) (f) et de protéines (n = 3 souris/groupe) (g) des marqueurs liés à l'inflammation dans les groupes indiqués. L'expression des protéines a été normalisée en β-ACTIN. h Analyse de regroupement hiérarchique des données ARN-seq des hépatocytes primaires stimulés par PAOA isolés de souris WT et Laptm5-KO. (ik) L'analyse d'enrichissement des voies GSEA et les Heatmaps montrent l'activation des voies et l'expression des gènes du métabolisme lipidique et inflammatoire. PAOA, 0,5 mM/1,0 mM ; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Pour toutes les analyses statistiques, les résultats sont représentés sous forme de moyenne ± SD. ANOVA unidirectionnelle du test post-hoc de Bonferroni (c, d—Scd1, d—Srebf1 et f—Tnf) et du test post-hoc de Tamhane T2 (b, d—Fasn, b—Pparg, f—Ccl2 et f —Cxcl10) a été utilisé pour évaluer les différences. Le test t de Student bilatéral a été utilisé pour évaluer les différences en (g). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour étudier plus avant l'influence de LAPTM5 sur la stéatohépatite et ses complications, nous avons construit des souris knock-out Laptm5 spécifiques aux hépatocytes (Laptm5-HKO) (Fig. 4a, b et Fig. 4a supplémentaires) et les avons élevées avec un régime alimentaire normal (NC) ou HFD. pendant 24 semaines. Les souris Laptm5-HKO suivant un régime alimentaire normal n'ont montré aucune différence de poids corporel, de poids du foie ou de profil lipidique par rapport aux souris Laptm5-Flox. Néanmoins, après 24 semaines de régime HFD, les souris Laptm5-HKO présentaient un poids du foie, un poids corporel, une glycémie à jeun et des taux de TG / TC dans le foie et le sérum plus élevés que le groupe témoin (Fig. 4b – h). De plus, ces mesures chez les souris Laptm5-HKO ont été encore exacerbées par rapport aux souris Laptm5-Flox. De plus, une plus grande accumulation de lipides dans le foie et sévère a également été observée chez les souris Laptm5-HKO nourries au HFD (Fig. 4i, j), avec une expression de gènes liés à l'absorption des lipides (Cd36) et à la synthèse (Fasn, Scd1, Pparg et Srebf1) étant régulé à la hausse (Fig. 4k – m). De plus, les foies des souris Laptm5-HKO ont subi une blessure plus grave en raison du régime HFD, comme en témoignent des niveaux plus élevés d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) par rapport aux témoins (Fig. 4n, o). Ces résultats ont révélé que la suppression de Laptm5 conduisait davantage la progression de la NAFLD.

a Taux de protéine LAPTM5 dans les tissus hépatiques des souris Laptm5-HKO et Laptm5-Flox (n = 3 souris/groupe). b Poids corporel des souris Laptm5-HKO et Laptm5-Flox après consommation de NC ou HFD pendant 24 semaines. c–e Glycémie à jeun (c), poids du foie (d) et rapports poids du foie/poids corporel (LW/BW) (e) des souris Laptm5-HKO et Laptm5-Flox après consommation de NC ou de HFD pendant 24 semaines. f – h Teneur en TG hépatique (f), TC (g) et TC sérique (h) des souris dans les groupes indiqués. i Images macroscopiques et histologiques du foie (gauche, barre d'échelle, 1 cm), H&E (milieu) et Oil Red O (droite) (barre d'échelle, 100 μm) coloration des coupes de foie de souris dans les groupes indiqués (n = 6 souris/groupe). j Analyse du score NAS (à gauche) et analyse statistique de la coloration Oil red O (à droite), (n = 6 souris/groupe). k et l Niveaux relatifs d'ARNm (n = 4 souris/groupe) (k) et de protéines (n = 3 souris/groupe) (l) des marqueurs pertinents dans les foies des groupes indiqués. m Coloration immunohistochimique de PPARγ dans des coupes de foie de souris dans les groupes indiqués (n = 6 souris/groupe). Barre d'échelle, 50 μm. n et o Concentrations sériques d'ALT et d'AST chez les souris des groupes indiqués. Pour b – h et n, o, n = 10 souris par groupe NC, n = 11 souris Laptm5-Flox et n = 10 souris Laptm5-HKO pour le groupe HFD. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD, ns, non significatif. Par ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Tamhane T2 pour (b–d, f–h, k-Scd1, k-Pparg et k-Srebf1, et n et o) et l'analyse post-hoc de Bonferroni pour (e, k -Cd36 et k-Fasn). Le test statistique non paramétrique Mann–Whitney U en (j—gauche) et le test t de Student bilatéral en (j—droite). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Étant donné que la NASH est le stade avancé de la NAFLD, nous avons nourri des souris Laptm5-Flox et Laptm5-HKO avec un régime HFHC pendant 16 semaines pour explorer davantage le rôle de LAPTM5 dans un modèle NASH de souris. Bien qu'aucune différence n'ait été trouvée dans le poids corporel, les indicateurs du métabolisme lipidique, tels que le poids du foie et la glycémie à jeun, et le dépôt de lipides se sont aggravés dans le groupe HKO 8 semaines après l'alimentation HFHC, et ces indicateurs ont été encore exacerbés à 16 semaines d'alimentation HFHC comme par rapport au groupe Flox (Fig. 5a – f et Supplémentaire Fig. 5a – d). Dans le même temps, l'infiltration inflammatoire et la fibrose hépatique se sont également détériorées avec une alimentation prolongée en HFHC (Fig. 5g – i et Supplémentaire Fig. 5e – i). Conformément aux résultats précédents, le déficit hépatique en Laptm5 a potentialisé les taux sériques d'ALT et d'AST (Fig. 5j). Pris ensemble, ces résultats ont démontré que le déficit en Laptm5 aggravait significativement la stéatohépatite et ses complications métaboliques. Ensuite, nous avons extrait l'ARNm des tissus hépatiques de souris Laptm5-HKO et Flox induites par HFHC pour le séquençage et examiné systématiquement le profil d'expression génique dans les deux groupes après la suppression de Laptm5 dans la NASH. Nous avons constaté que, dans la NASH, le déficit hépatique en Laptm5 provoquait la régulation à la hausse d'un large éventail de voies et de gènes qui favorisent le métabolisme des lipides, l'inflammation et la fibrose (Fig. 5k – n).

a Glycémie à jeun de souris Laptm5-HKO et Laptm5-Flox pour consommations NC ou HFHC (n = 10 souris/groupe). b et c Poids du foie et LW/BW (b), et contenu hépatique en TG, TC (c) des souris Laptm5-HKO et Laptm5-Flox après alimentation NC ou HFHC pendant 8 ou 16 semaines (n = 10 souris/groupe). d Coloration H&E (en haut) et Oil Red O (en bas) dans les coupes de foie de souris dans les groupes indiqués (n = 6 souris/groupe). Barre d'échelle, 100 μm. e et f Analyse des scores NAS (e) et analyse statistique de la coloration Oil red O (f) des souris Laptm5-HKO et Laptm5-Flox après alimentation NC ou HFHC pendant 8 ou 16 semaines (n = 6 souris/groupe). g Coloration par immunofluorescence (g) et analyse statistique (h, i) de CD11b (rouge) dans les coupes de foie de souris dans les groupes indiqués. (Nuclei, bleu) (n = 4 souris/groupe). Barre d'échelle, 50 μm. Coloration PSR de coupes de foie de souris dans les groupes indiqués. (8 semaines, n = 6 souris/groupe, 16 semaines, n = 7 souris Laptm5-Flox et n = 5 souris Laptm5-HKO). Barres d'échelle, 100 μm. j Concentrations sériques d'ALT et d'AST des souris dans les groupes indiqués (n = 10 souris/groupe). k Analyse de regroupement hiérarchique des données d'ARN-seq des souris nourries avec le régime HFHC. l et m Analyse d'enrichissement des voies GSEA des voies liées au métabolisme des lipides, à l'inflammation, à l'apoptose et à la fibrose. n Cartes thermiques des gènes liés au métabolisme des lipides, aux réponses inflammatoires et à la fibrose (rouge, régulé à la hausse ; bleu, régulé à la baisse) dans les groupes indiqués. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD. Le test statistique non paramétrique Mann–Whitney U a été utilisé pour l'analyse statistique dans (c—8w, e—16w et i—16w) et le test t de Student bilatéral dans d'autres panels. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Compte tenu de l'hétérogénéité de la NASH, nous avons ensuite évalué le rôle de LAPTM5 dans un modèle de souris NASH induite par un régime déficient en méthionine et en choline (MCD) et avons constaté que l'infiltration inflammatoire et les lésions hépatiques étaient nettement plus graves25. Conformément aux résultats du modèle NASH induit par HFHC, le déficit en Laptm5 a manifestement favorisé les troubles métaboliques hépatiques induits par le régime MCD et les lésions hépatiques (Fig. 6a – g supplémentaires). En résumé, la déplétion de Laptm5 aggrave la NASH chez la souris.

Pour confirmer le rôle de Laptm5 hépatique dans la pathogenèse de la NASH, nous avons construit un modèle de souris transgénique Laptm5 spécifique aux hépatocytes (Laptm5-HTG) (Fig. 7a et b supplémentaires), les compagnons de litière (NTG) servant de témoins. Les souris HTG présentaient un poids du foie et des rapports de poids foie sur corps inférieurs, mais aucun changement significatif n'a été observé dans le poids corporel par rapport aux souris NTG 16 semaines après l'alimentation HFHC. L'augmentation de la glycémie induite par HFHC et l'aggravation du profil lipidique ont également été atténuées par la surexpression de Laptm5 (Fig. 7c – g supplémentaire). De plus, les souris HTG présentaient une stéatose hépatique moins sévère que leurs homologues NTG (Fig. 7h, i supplémentaires). Coïncidant avec les résultats susmentionnés, la surexpression de Laptm5 a considérablement atténué l'inflammation, la fibrose et les lésions hépatiques au cours de la progression de la NASH (Fig. 7j – p supplémentaires). Ensemble, ces résultats ont démontré que LAPTM5 protège contre la stéatohépatite et ses complications métaboliques.

Pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent à la protection induite par LAPTM5 contre la NASH, nous avons intégré les résultats du séquençage de l'ARN et l'analyse de la voie de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) et avons constaté que l'inactivation de Laptm5 modifiait le plus significativement la voie de signalisation MAPK (Fig. 6a ). Le transfert Western a démontré que la voie de signalisation MAPK était supprimée par la surexpression de Laptm5, mais renforcée par la suppression de Laptm5 à la fois in vitro et in vivo (Fig. 6b – e). Pour identifier la cible spécifique médiant la suppression de la voie de signalisation MAPK, nous avons effectué une spectrométrie de masse IP sur des hépatocytes L02 surexprimant Laptm5 et découvert que LAPTM5 interagissait avec la petite protéine de liaison au GTP CDC42 (Cell Division Cycle 42) (Fig. 6f) , qui avait été signalé comme un activateur majeur de la voie JNK stimulée par les acides gras saturés dans les hépatocytes26. Nous avons ensuite confirmé que la surexpression de CDC42 aggravait de manière significative l'accumulation de lipides, la réponse inflammatoire et favorisait l'activation de la voie de signalisation MAPK dans les hépatocytes, la découverte étant cohérente avec les résultats précédemment rapportés (Fig. 8a – e supplémentaires). Par la suite, l'interaction entre LAPTM5 et CDC42 a été davantage corroborée par les tests CO-IP et GST (Fig. 6g, h), et de plus, l'interaction était plus robuste lors de la stimulation de l'AP (Fig. 6i). De plus, la surexpression de Laptm5 a inhibé l'expression protéique de CDC42 sous stimulation PA, mais n'a pas eu un tel effet en condition BSA, les résultats étant vérifiés à la fois dans les cellules L02 et les hépatocytes primaires (Fig. 6j, k). Alors que le knock-out de Laptm5 favorisait l'expression de CDC42 sous stimulation PA, ce qui n'était pas non plus cohérent avec le résultat dans l'état BSA (Fig. 6l). Ensuite, nous avons examiné plus en détail les niveaux de protéines de CDC42 dans les tissus hépatiques d'individus NASH ou non NASH, et l'expression de CDC42 s'est avérée significativement régulée à la hausse dans le groupe NASH, suggérant que LAPTM5 et CDC42 étaient négativement corrélés (Fig. 6m), et un axe de régulation NASH existait entre LAPTM5 et CDC42. Pour identifier la voie spécifique de la dégradation de la protéine CDC42 médiée par LAPTM5, les cellules surexprimant LAPTM5 ont été traitées avec MG132 ou Chlq. Nous avons constaté que l'inhibiteur lysosomal Chlq pouvait abolir l'effet inhibiteur de LAPTM5 sur CDC42 (Fig. 6n, o). Liang et al. et Guo et al. ont démontré que LAPTM5 pouvait réguler la progression de diverses maladies systémiques, telles que les tumeurs et le VIH, en favorisant la dégradation lysosomale des protéines pertinentes. Par conséquent, nous avons été amenés à émettre l'hypothèse que la régulation à la baisse de CDC42 était médiée par la dégradation lysosomale de LAPTM5. De plus, la coloration de co-localisation par immunofluorescence a montré que CDC42 était uniformément réparti dans le cytoplasme dans des conditions de BSA (Fig. 8f supplémentaire). Cependant, après le traitement par PA, CDC42 s'est progressivement déplacé vers les lysosomes et est devenu granuleux et finalement co-localisé avec des lysosomes dans les cellules surexprimant LAPTM5, suggérant que LAPTM5 facilitait le transport endocytaire lysosomal de CDC42 et favorisait sa dégradation par les lysosomes (Fig. 6p).

a Résultats combinés de l'analyse KEGG montrant la voie MAPK la plus enrichie. b et c Images Western blot (b) et résultats quantitatifs (c) des taux de protéines phosphorylées et totales de p38, JNK1/2 et ERK1/2 dans les foies de souris des groupes indiqués (n = 3 souris/groupe). Les données représentent la moyenne ± SD, un test t de Student bilatéral a été utilisé pour évaluer les différences. d et e Images de Western blot montrant les niveaux de protéines phosphorylées et totales de p38, JNK1/2 et ERK1/2 dans les cellules du groupe indiqué. f Schéma d'identification de la protéine interagissant avec LAPTM5 par analyse IP-MS. g et h Co-IP (g) et GST pull-down (h) montre l'interaction entre LAPTM5 et CDC42. i Tests Co-IP pour examiner la différence de force de liaison entre LAPTM5 et CDC42 après la stimulation de PA. j et k Western blot résultats de l'expression exogène (j) et endogène (k) de CDC42 après surexpression de différentes concentrations de LAPTM5. ( l ) Images de Western blot (haut) et analyse quantitative (bas) de l'expression de CDC42 dans les hépatocytes de souris LAPTM5-KO après stimulation par PA (n = 3 souris / groupe). Les données représentent la moyenne ± SD, et l'ANOVA unidirectionnelle du test post-hoc de Bonferroni a été utilisée pour évaluer les différences. m Images Western blot de l'expression de LAPTM5 et CDC42 dans le groupe NASH ou non NASH (n = 5 personnes/groupe). n Résultat Western blot de l'expression exogène de CDC42 après surexpression de LAPTM5 sous traitement Chlq ou MG132. o Images Western blot de la tendance à l'expression exogène de CDC42 avec surexpression de LAPTM5 dans un gradient sous le traitement de Chlq. p Images de microscopie confocale de la co-localisation de LAMP1 (vert) et CDC42 (rouge) dans les cellules L02 des groupes indiqués (Nuclei, bleu). Barre d'échelle, 8 μm (n = 3 expériences indépendantes). PAOA, 0,5 mM/1,0 mM ; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Chlq, 50 μM ; MG132, 50 μM. Les immunotransferts sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ensuite, nous avons essayé de valider la présence de l'axe régulateur LAPTM5-CDC42 dans la progression de la NASH. Nous avons induit la surexpression de CDC42 dans des hépatocytes surexprimant Laptm5. Nos résultats ont montré que la surexpression de CDC42 pouvait supprimer l'effet protecteur de LAPTM5 sur les stress du métabolisme lipidique, tels que le profil lipidique défavorable et la voie de signalisation MAPK régulée à la hausse lorsque CDC42 était surexprimé (Fig. 7a – d). Au contraire, l'inactivation de CDC42 a réussi à entraver l'aggravation de l'accumulation de lipides et de l'inflammation dans les hépatocytes lorsque Laptm5 a été assommé (Fig. 7e – h). Collectivement, ces résultats indiquent que LAPTM5 joue un rôle protecteur dans la NASH en médiant l'homéostasie protéique de CDC42.

une analyse Western blot de JNK1/2 totale et de phosphorylation, et de p38 après surexpression a indiqué des plasmides dans des cellules L02. b – d Coloration au rouge du Nil (b) et teneur en TG (d) des cellules L02 après traitement au PAOA dans les groupes indiqués. Barre d'échelle, 25 μm (n = 3 expériences indépendantes). e Analyse Western blot des hépatocytes primaires knock-out Laptm5 infectés par l'adénovirus knock-down CDC42 dans les groupes indiqués. f – h Coloration au rouge du Nil (f) et teneur en TG (h) des hépatocytes primaires après traitement au PAOA dans les groupes indiqués (n = 3 expériences indépendantes). PAOA, 0,5 mM/1,0 mM ; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Chlq, 50 μM ; MG132, 50 μM. Les données représentent la moyenne ± SD, l'ANOVA unidirectionnelle du test post-hoc de Bonferroni a été utilisée pour évaluer les différences entre (c, d) et (g, h). Les immunotransferts sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Enfin, nous avons examiné l'effet thérapeutique du ciblage de l'axe LAPTM5-CDC42 dans la NASH. Un adénovirus surexprimant Laptm5 (AdLAPTM5) a été injecté à des souris soumises à un régime HFHC pendant 8 semaines. Ensuite, les souris ont été nourries avec le régime HFHC pendant encore 4 semaines, AdGFP a été utilisé comme contrôle (Fig. 8a). L'analyse par Western blot a confirmé que LAPTM5 était surexprimé et que l'expression de p-JNK1/2 et CDC42 était régulée à la baisse dans le foie des souris traitées avec AdLAPTM5 (Fig. 8b). Par rapport aux souris AdGFP, les souris ayant reçu l'injection d'AdLAPTM5 ont montré que la glycémie à jeun, le poids du foie et le rapport poids du foie/poids corporel étaient significativement diminués (Fig. 8c, d). De plus, la surexpression de Laptm5 médiée par l'adénovirus a considérablement amélioré l'accumulation de lipides, l'inflammation et les lésions hépatiques dans le foie des souris nourries au HFHC (Fig. 8e – m). Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que LAPTM5 a de bonnes chances de servir de cible thérapeutique pour le traitement de la NASH et des troubles métaboliques.

un schéma de construction de modèles NASH thérapeutiques médiés par AdLAPTM5 chez des souris HFHC. b Représente les résultats de détection WB des protéines indiquées dans les groupes (n = 3 souris/groupe). c et d Glycémie à jeun (c), poids du foie et LW/BW (d) des souris dans les groupes indiqués (n = 10 souris/groupe). e Contenu hépatique en TG et TC des souris du groupe indiqué (n = 10 souris/groupe). f H&E (supérieur) (n = 6 souris/groupe) et Oil Red O (inférieur) (n = 5 souris/groupe) coloration dans les coupes de foie. Barre d'échelle, 100 μm. g Analyse du score NAS du groupe dans le panel (f) (n = 6 souris/groupe). h Analyse statistique de Oil red O dans le groupe du panel (f) (n = 5 souris/groupe). i Niveaux relatifs d'ARNm des gènes liés au métabolisme des acides gras dans le foie des souris dans les groupes indiqués (n = 6 souris/groupe). j et k Coloration par immunofluorescence (j) et analyse statistique (k) de CD11b (rouge) dans les coupes de foie de souris nourries au HFHC dans les groupes indiqués (n = 5 souris/groupe). Barre d'échelle, 50 μm. l Niveaux relatifs d'ARNm des gènes pro-inflammatoires dans le foie des souris des groupes indiqués (n = 6 souris/groupe). m Concentrations sériques d'ALT et d'AST des souris dans les groupes indiqués (n = 10 souris/groupe). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD, le test t de Student bilatéral a été utilisé pour évaluer les différences dans tous les panels. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nos résultats ont démontré que LAPTM5 pouvait être dégradé par l'ubiquitination par NEDD4L sous stress métabolique. La surexpression de LAPTM5 a atténué la stéatose hépatique, la réponse inflammatoire et la fibrose. Mécaniquement, LAPTM5 peut se lier directement à CDC42, favoriser sa dégradation lysosomale, puis inhiber l'activation de la voie de signalisation de la kinase c-Jun NH2-terminale, servant ainsi sa fonction. L'hépatocyte LAPTM5 est une cible thérapeutique prometteuse pour la NASH.

LAPTM5 est une protéine transmembranaire multi-spanning contenant un motif d'interaction avec l'ubiquitine (UIM) et trois motifs PY qui se lient aux domaines Nedd4-WW. Dans le même temps, le complexe NEDD4-LAPTM5 recrute la liaison GGA3 ubiquitinée au LAPTM5-UIM27. Une étude précédente a rapporté que l'E3 ubiquitine ligase ITCH se lie à LAPTM5 et la régule négativement par la voie de l'ubiquitination28. Notre étude a montré que LAPTM5 était significativement diminué dans les modèles NASH et que sa régulation à la baisse se faisait via la voie ubiquitine-protéasome. Ensuite, nous avons découvert que les ligases d'ubiquitine NEDD4L et E3 interagissaient avec LAPTM5 et favorisaient l'ubiquitination liée à K48 de LAPTM5. Par conséquent, cibler la boucle de régulation physiologique de NEDD4L-LAPTM5 pourrait être une stratégie efficace pour traiter la NASH.

Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathogenèse de la NASH sont multifactoriels et complexes29, de multiples études ont montré que la voie de signalisation MAPK est impliquée dans le développement et la progression de la NASH. Un régime riche en graisses pourrait activer l'expression de JNK dans le foie30. Dans les modèles cellulaires de NASH, l'acide gras saturé (acide palmitique) a activé le PPARα, entraînant un dysfonctionnement mitochondrial dépendant de c-JNK et la mort des hépatocytes31. La voie de signalisation P38 joue un rôle important dans la réponse cellulaire provoquée par l'inflammation et l'apoptose cellulaire induite par le stress32. Glowacka et al. et Chen et al. ont prouvé que LAPTM5 jouait un rôle important dans la modulation et l'activation de la voie de signalisation MAPK15,33. Dans cette étude, l'analyse bioinformatique, en combinaison avec l'étude moléculaire, a montré que l'activation de JNK1/2 et p38 était inhibée par la surexpression de LAPTM5 mais renforcée par la suppression de LAPTM5 dans les modèles NASH.

De plus, des études récentes ont documenté que les petites protéines de liaison au GTP CDC42 jouent un rôle important dans la pathogenèse de la NASH en modulant l'activation de la voie de signalisation MAPK34. L'activation de CDC42 est nécessaire pour l'activation dépendante de MLK3 stimulée par SFA de JNK dans les hépatocytes, et une diminution de l'expression de CDC42 peut atténuer l'activation de JNK26. Conformément à ces résultats, notre étude a révélé que LAPTM5 interagissait avec CDC42 et régulait son expression. De plus, la surexpression de CDC42 a aboli l'effet protecteur de LAPTM5 sur le métabolisme des lipides. LAPTM5 a principalement modulé la progression de la NASH en régulant l'expression de CDC42 et l'activation de la voie de signalisation MAPK.

L'interaction entre LAPTM5 et CDC42 n'a pas encore été élucidée. LAPTM5 est localisé dans la membrane lysosomale et impliqué dans un large éventail de processus pathologiques et physiologiques. Kawaï et al. ont rapporté que LAPTM5 favorisait la translocation lysosomale et la dégradation de CD3ζ14. Ouchida et al. ont démontré que LAPTM5 interagissait avec BCR et favorisait sa dégradation lysosomale dans les cellules B de souris35. Entre-temps, plusieurs études récentes ont démontré que LAPTM5 pouvait réguler la progression de certaines affections systémiques, telles que les tumeurs malignes et le VIH, en favorisant la dégradation lysosomale des protéines pertinentes36,37. De plus, la voie de dégradation lysosomale joue également un rôle important dans la progression de la NASH. Des études antérieures ont prouvé que TMBIM1 favorisait la dégradation lysosomale du TLR4 et inhibait la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses, la stéatose hépatique et l'inflammation38. Dans la présente étude, nous avons constaté que LAPTM5 pouvait favoriser la localisation et la dégradation lysosomales de CDC42 sous la stimulation de PA. Cependant, l'expression et la localisation de CDC42 n'ont pas été influencées dans la condition BSA. Cela indique que la corrélation entre LAPTM5 et CDC42 peut avoir changé après le traitement de l'AP. Par exemple, il peut y avoir des changements dans les domaines protéiques et l'activité moléculaire de LAPTM5 et CDC42 après stimulation PA. Youngshil et al. ont rapporté que les fonctions de trafic et de tri des protéines de LAPTM5 étaient strictement régulées par différents domaines de celle-ci27. Manju et al. ont rapporté que l'activation de CDC42 joue un rôle clé dans la régulation de la progression de la maladie et que l'intensité de l'activité de CDC42 affecte également sa fonction biologique26. Par conséquent, après la stimulation de l'AP, des changements délicats et complexes peuvent s'être produits à l'intérieur des cellules. Et ces mécanismes profonds nécessitent une étude plus approfondie.

En résumé, dans cette étude, nous avons identifié LAPTM5 comme un suppresseur non rapporté de la NASH qui pourrait réguler négativement la voie p38/c-JNK en favorisant la dégradation du lysosome CDC42 dans les hépatocytes. Notre étude a montré que la thérapie Laptm5 médiée par l'adénovirus était efficace contre la NASH et que l'expression de la protéine LAPTM5 était corrélée à la progression clinique de la NASH. Ces résultats indiquent que le ciblage de Laptm5 spécifique aux hépatocytes peut être une alternative thérapeutique efficace pour le traitement de la NASH et mérite des recherches précliniques plus poussées.

Certaines questions concernant le rôle de LAPTM5 dans le traitement de la NASH restent sans réponse. Par exemple, comment LAPTM5 transporte-t-il CDC42 vers le lysosome pour sa dégradation protéique, et plus précisément comment se déroule le processus ? Comment CDC42 régule-t-il l'activité des voies p38 et JNK1/2 en aval ? Toutes ces questions méritent d'être approfondies. De plus, la corrélation entre LAPTM5 et NASH reste à vérifier par des essais cliniques à grande échelle. Notre expérience a été menée sur des souris et des études impliquant des modèles NASH d'animaux plus grands, tels que des primates, sont nécessaires avant de passer aux essais cliniques.

Les principaux réactifs, anticorps et amorces utilisés dans cette étude sont répertoriés dans les documents supplémentaires.

Tous les soins aux animaux et les expériences connexes décrites dans cette étude ont été réalisées conformément aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire rédigées par les National Institutes of Health des États-Unis (NIH Publication, 8e édition, 2011). Les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux du Tongji Medical College et de l'Université des sciences et technologies de Huazhong ont approuvé les protocoles animaux utilisés dans cette étude.

Des souris mâles adultes C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines et pesant 22 à 30 g ont été hébergées dans des conditions exemptes d'agents pathogènes dans un environnement à température contrôlée à 22 à 24 °C, un environnement à humidité contrôlée à 40 à 70 % sous un Cycle lumière/obscurité de 12 h avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. Les souris étaient généralement en bonne santé avant HFD (protéines, 20 % ; lipides, 60 % ; glucides, 20 % ; H10060, Beijing HUAFUKANG Bioscience Co., Ltd) pendant 24 semaines pour établir un modèle de foie gras, HFHC (42 % de lipides, 44 % de glucides, 14 % de protéines et 0,2 % de cholestérol ; TP26304 ; Trophic Diets, Nantong, Chine) pendant 16 semaines, MCD (TP3005G ; Trophic Diets, Nantong, Chine) pendant 4 semaines pour établir le modèle NASH ou NCD ( protéines, 18 % ; lipides, 4 % ; glucides, 78 % ; 1010001, Jiangsuxietong, Chine) et MCS (TP3005GS ; Trophic Diets, Nantong, Chine). La dislocation cervicale a été utilisée pour l'euthanasie des souris. Tous les animaux ont été nourris et élevés à la Division des ressources animales de laboratoire du Tongji Medical College.

La collecte et l'application d'échantillons humains ont été réalisées sous la supervision du comité d'éthique de l'hôpital Renmin de l'Université de Wuhan avec le numéro d'éthique WDRY2018-K001 et respectaient les principes de la Déclaration d'Helsinki. Toutes les personnes ont signé un consentement éclairé pour l'utilisation d'échantillons cliniques dans la présente étude.

Nous avons obtenu des échantillons de foie stéatosique humain de patients atteints de stéatose simple ou de NASH qui avaient subi une biopsie hépatique ou une transplantation hépatique. Les échantillons de foie non stéatosique ont été obtenus à partir des régions saines du foie de donneurs ayant subi une résection hépatique en raison de kystes hépatiques ou d'un hémangiome hépatique. Les personnes inscrites à cette étude ont été exclues de l'infection par le virus de l'hépatite, de la toxicomanie ou de la consommation excessive d'alcool (> 140 g pour les hommes ou > 70 g pour les femmes, par semaine). Les échantillons de foie des patients proviennent du groupe non NASH de 16 personnes et du groupe NASH de 20 personnes. Pour le groupe non-NASH, il y a 9 patients de sexe féminin et 7 patients de sexe masculin dont l'âge varie de 27 à 67 ans. Pour le groupe NASH, il y a 13 femmes et 7 hommes dont l'âge varie de 19 à 40 ans.

Des souris Laptm5-flox ont été générées à l'aide du système CRISPR/Cas9 en arrière-plan C57BL/6. Deux ARN à guide unique (ARNsg) (énumérés dans le tableau S1) ciblant les introns 1 et 2 de Laptm5 ont été conçus à l'aide d'un outil de conception CRISPR en ligne (http://chopchop.cbu.uib.no/). Des vecteurs d'expression de sgRNA ont été construits en utilisant un squelette pUC57-sgRNA (Addgene, 51132). Nous avons également conçu un vecteur donneur qui comprenait deux bras homologues, une région codante médiane (CDS) et deux séquences loxP dans la même direction pour la réparation par recombinaison homologue. Ensuite, les vecteurs d'expression sgRNA et Cas9 (Addgene, 44758) ont été transcrits in vitro, et le mélange d'ARNm obtenu in vitro avec le vecteur donneur a été injecté dans les zygotes de souris à l'aide d'un appareil de microinjection. Les zygotes injectés ont ensuite été transplantés dans l'utérus de souris receveuses, et des souris Laptm5-flox ont été obtenues par génotypage. Par la suite, les souris fondatrices ont été accouplées avec des souris C57BL/6 jusqu'à ce que des souris Laptm5-flox/flox soient obtenues et accouplées avec des souris transgéniques Alb-Cre spécifiques du foie (JAX, 003574). Des souris Laptm5-flox/flox/Alb Cre (Laptm5-HepKO) ont été criblées. Les amorces d'identification utilisées sont répertoriées dans les tableaux P1 à P5.

La région CDS de Laptm5 a été amplifiée à partir d'ADNc de souris obtenu par transcription inverse pour construire le vecteur de surexpression pALB. Les plasmides correctement séquencés ont été linéarisés par l'endonucléase de restriction PvuI ; les fragments récupérés ont été purifiés et utilisés pour la microinjection, par la suite, des souris de génération F0 ont été obtenues et identifiées. Les premières souris positives ont été accouplées avec le type sauvage, et les souris positives de la génération F1 ont été sélectionnées pour l'accouplement afin d'obtenir une souche de souris transgénique Laptm5 génétiquement stable et spécifique du foie. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau S3.

Des hépatocytes primaires ont été isolés à partir de souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines. Brièvement, les souris ont été anesthésiées puis la cavité abdominale a été ouverte. La veine cave hépatique inférieure a été perfusée avec une solution de lavage jusqu'à ce que le foie devienne jaune. Enfin, la solution de lavage contenant 0,05 % de collagénase IV a été utilisée pour digérer le foie. Ensuite, le foie a été retiré et la capsule hépatique a été ouverte avec une microforceps. Ensuite, les tissus ont été filtrés sur un tamis cellulaire de 100 μm pour obtenir des hépatocytes primaires, qui ont ensuite été centrifugés à 50 xg pendant 3 min et purifiés dans une solution de Percoll à 50 %. Les hépatocytes primaires purifiés ont été cultivés dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur saturé à 5 % de dioxyde de carbone/eau à 37 °C.

Les lignées cellulaires d'hépatocyte humain L02, de rein embryonnaire humain 293 et ​​293T ont été achetées auprès de la collection de cultures types de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Toutes les lignées cellulaires ont été examinées pour la contamination par les mycoplasmes et les résultats ont été négatifs. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur saturé à 5 % de dioxyde de carbone/eau à 37 °C. Avant les expériences, toutes les lignées cellulaires ont été vérifiées par un profilage d'ADN répété en tandem court. Toutes les lignées cellulaires de notre laboratoire ont été passées pas plus de 30 fois après réanimation et testées en routine pour la contamination par les mycoplasmes par PCR. Pour établir un modèle de stéatose hépatique in vitro, des hépatocytes primaires de souris et des cellules L02 ont été stimulés avec de l'acide palmitique (PA ; 0,5 mM ; P0500 ; Sigma-Aldrich ; St. Louis, MO, USA) et de l'acide oléique (OA ; 1,0 mM ; O -1008 ; Sigma-Aldrich ; St. Louis, MO, USA) (dissous dans 0,5 % de BSA sans acide gras) aux concentrations indiquées pendant 12 à 24 h. Pour le groupe témoin, les cellules ont été stimulées avec de la BSA sans acide gras (0,5 % ; BAH66-0100 ; Equitech Bio, Kerrville, TX, USA). Pour déterminer si LAPTM5 facilite la dégradation protéasomique de CDC42, les cellules ont été traitées avec 50 μmol/L de Chlq (S6999 ; Selleck Chemicals) pendant 12 h.

Les taux de glycémie à jeun et les niveaux de poids corporel des souris ont été évalués toutes les 4 semaines, et les taux de glycémie à jeun ont été mesurés à l'aide d'un glucomètre (Life Scan, Milpitas, CA, USA). Les concentrations sériques de TC, ALT et AST ont été mesurées à l'aide d'un analyseur de système de chimie ADVIA 2400 (Siemens, Tarrytown, NY, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant.

Les teneurs en TG et TC (290-63701 pour TG, 294-65801 pour TC ; Wako ; Tokyo, Japon) des hépatocytes primaires, des cellules L02 et des tissus hépatiques ont été mesurées à l'aide de kits commerciaux conformément aux instructions du fabricant.

Les tissus hépatiques de souris ont été fixés avec du formaldéhyde à 10 % pendant 48 h, et le bloc de tissu a ensuite été coupé et intégré par déshydratation des tissus. Les coupes de foie incluses dans l'OCT ont été colorées avec Oil Red O (O0625 ; Sigma-Aldrich ; St. Louis, MO, USA), et les coupes de foie incluses dans la paraffine ont été colorées avec H&E (Hematoxylin, G1004, Servicebio, Wuhan, Chine ; Eosin , BA-4024, Baso, Zhuhai, Chine) et le rouge picrosirius (PSR ; 26357-02 ; Hede biotechnologie ; Pékin, Chine), qui ont été utilisés pour les tests de fibrose hépatique. Toutes les images histologiques ont été acquises au microscope optique (ECLIPSE 80i ; Nikon, Tokyo, Japon).

L'immunohistochimie pour l'analyse de PPARγ et l'expression de CD11b ont été réalisées sur des coupes de foie incluses en paraffine (5 μm) à l'aide de PPARγ (dilution 1:400, 2435T, Cell Signaling Technology), CD11b (dilution 1:4000, BM3925, Boster; Wuhan, Chine) et les anticorps LAPTM5 (dilution 1:200, sc134676, Santa Cruz). Pour la récupération d'antigène, les échantillons ont été chauffés dans un autocuiseur pendant 5 min dans une solution de récupération d'antigène tissulaire au citrate pH_6,0. Après refroidissement, les échantillons ont été placés dans 3% H2O2 pendant 20 min pour désactiver l'activité peroxyde endogène. Les lames ont ensuite été bloquées avec 10% de BSA pendant 30 min après lavage au PBS. Par la suite, les sections ont été incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C, après trois lavages avec du PBS (5 min/lavage), en incubant les sections avec le kit de détection en deux étapes de lapin (PV-9001, ZSGB-BIO ; Pékin, Chine) selon le protocole du fabricant. La coloration immunohistochimique a été visualisée à l'aide d'un kit de substrat de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) (ZLI-9018; ZSGB-BIO, Pékin, Chine) et d'une contre-coloration à l'hématoxyline. Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope optique (ECLIPSE 80i ; Nikon, Tokyo, Japon).

Pour effectuer la coloration par immunofluorescence CD11b, après la récupération de l'antigène, des coupes de paraffine de tissus hépatiques ont d'abord été marquées avec un anticorps primaire anti-CD11b (dilution 1: 800, BM3925, Boster; Wuhan, Chine) à 4 ° C pendant la nuit, puis incubées avec un fluorophore -anticorps secondaire conjugué [Alexa Fluor 568 chèvre anti-lapin IgG (H+L) ; A11036; Invitrogène; Carlsbad, Californie, États-Unis] à 37 °C pendant 1 h. Les images d'immunofluorescence ont été acquises au microscope à fluorescence (BX51; Olympus, Tokyo, Japon).

Les cellules L02 et les hépatocytes primaires de souris ont été traités avec du PAOA pendant 0, 12 ou 24 h. Les cellules ont ensuite été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min et colorées avec du rouge de Nil (1 mM dans du PBS ; 22190 ; Fanbo Biochemicals ; Pékin, Chine). L'accumulation de lipides a été visualisée et quantifiée à l'aide de la microscopie confocale à balayage laser (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Allemagne) ou d'un système d'analyse à haut contenu (Operetta CLS, Waltham, MA, États-Unis).

Pour la coloration de la lamelle, les hépatocytes L02 transfectés avec des plasmides apparentés ont été incubés avec des anticorps de souris anti-LAMP1 et de lapin anti-CDC42 à 37 ° C pendant 2 h, puis marqués avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore. Les noyaux de toutes les images ont été colorés avec du DAPI (S36939; Invitrogen; Carlsbad, Californie, États-Unis) et les images ont été acquises avec un microscope confocal à balayage laser (TCS SP8; Leica; Wetzler, Allemagne). Avant le chargement du colorant, les cellules ont été traitées avec du PA (0, 5 mM) en présence de Chlq (50 μM) pendant 12 h.

Les produits de PCR des protéines transmembranaires lysosomales ont été obtenus à partir de bibliothèques d'ADNc et clonés dans des vecteurs correspondants pour obtenir des plasmides surexprimés. Les séquences complètes des régions codantes humaines LAPTM5, NEDD4, WWP2, ITCH et CDC42 ont été sous-clonées dans les vecteurs pcDNA5-HA, pcDNA5-Flag, pcDNA5-Myc et pcDNA5-GST-HA pour générer Flag-LAPTM5, HA-NEDD4, HA -WWP2, HA-ITCH, Myc-CDC42, GST-HA-LAPTM5 et GST-HA-CDC42 plasmides recombinants respectivement. De même, les séquences complètes de NEDD4L humain ont été insérées dans le vecteur pcDNA3.1-HA pour générer HA-NEDD4L, puis HA-NEDD4L (C943S) a été amplifié. Le système d'emballage de lentivirus comprenait deux plasmides d'emballage, pMD2.G et psPAX2, et un plasmide cible phage-Flag-LAPTM5. Ils ont été mélangés et assemblés pour infecter les cellules HEK 293 T. Après 48 h d'infection, le surnageant des cellules HEK 293 T a été collecté pour infecter les cellules L02 avec du polybrène (8 μM; H9268; Sigma, St. Louis, MO, USA) pour faciliter la transfection. La puromycine (A1113803; Gibco, Grand Island, NY, USA) a été utilisée pour générer des lignées cellulaires stables de surexpression de LAPTM5, et la protéine fluorescente verte lentivirale (lenti-GFP) a été utilisée comme contrôle.

Le plasmide navette pENTR-U6-CMV-flag-T2A-EGFP et le ViraPower Adenoviral Expression System (V493-20; Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) ont été utilisés pour générer des vecteurs adénoviraux surexprimant LAPTM5 de souris. Après linéarisation avec Pacl (R0547L; NEB, MA, USA), les vecteurs adénoviraux ont été transfectés dans des cellules 293 en utilisant le réactif de transfection polyéthylèneimine (24765-1; Polysciences, Warrington, UK). Les cellules ont été récoltées après 6 à 7 jours pour obtenir l'adénovirus initial. Après trois générations d'amplification, l'adénovirus LAPTM5 a été purifié par centrifugation en gradient de densité de chlorure de césium, et le titre a été mesuré en utilisant la méthode de la dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50). Des hépatocytes primaires de souris ont été infectés par un adénovirus à une multiplicité d'infection (MOI) de 50. Pour les essais in vivo, un adénovirus exprimant la protéine LAPTM5 de souris ou GFP (acheté auprès de HANBIO ; Shanghai, Chine) a été injecté par voie intrapéritonéale 8 semaines après la consommation de HFHC.

La protéine totale a été isolée et lysée à partir de tissus ou de cellules animales par un tampon de lyse RIPA, et les protéines ont été quantifiées à l'aide du kit d'analyse de protéines Pierce BCA (23225, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Des quantités égales des protéines indiquées ont été chargées sur un gel SDS-PAGE à 10% et transférées sur des membranes PVDF. Les membranes de PVDF ont ensuite été bloquées avec du lait écrémé à 5 % dissous dans du TBST et incubées avec des anticorps primaires correspondants pendant une nuit à 4 ° C, suivis d'anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 1 h. Les protéines ont ensuite été détectées à l'aide d'un kit ECL et visualisées à l'aide du système d'imagerie ChemiDoc XRS+.

L'ARNm total a été extrait de tissus animaux et de cellules cultivées à l'aide de TRIzol, et l'ADNc a été préparé à l'aide des réactifs de transcription inverse de Vazyme. La qPCR a été réalisée à l'aide de SYBR Green conformément aux instructions du fabricant. Les niveaux d'expression d'ARNm des gènes apparentés ont été normalisés à ceux du gène domestique β-actine.

L'immunoprécipitation (IP) a été réalisée pour détecter les interactions entre les protéines. En bref, des cellules HEK293T ou L02 ont été cotransfectées avec les plasmides indiqués. Après transfection pendant environ 16 à 24 h, les cellules ont été lysées à l'aide d'un tampon de lyse IP 150 mM glacé (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; et 1% NP-40) contenant un inhibiteur de protéase cocktail (04693132001; Roche; Bâle, BS, Suisse). Après centrifugation (12 000 × g pendant 10 min), le surnageant a été récupéré dans un tube EP frais. Chaque échantillon a ensuite été incubé avec des billes d'agarose de protéine A/G (AA104307 ; Bestchrom ; Shanghai, Chine) pendant 1 h, puis avec les anticorps indiqués à 4 °C pendant une nuit. Après centrifugation (3500 xg pendant 5 min), les billes ont été lavées trois fois avec du tampon de lyse IP 300 mM et deux fois avec du tampon de lyse IP 150 mM. Enfin, les billes ont été chauffées à 95 ° C dans un tampon de chargement SDS pendant 15 min et séparées par SDS – PAGE pour le Western Blot.

Les cellules L02 cotransfectées avec les plasmides indiqués ont été lysées dans 80 μL de tampon de lyse IP 150 mM et 10 μL de tampon de lyse SDS à 10 %, puis dénaturées par chauffage à 95 °C pendant 15 min. Après chauffage, 900 μL de tampon de lyse IP 150 mM contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase ont été ajoutés aux lysats. Après sonication et centrifugation (12 000 × g pendant 15 min), le surnageant a été collecté et incubé avec les anticorps indiqués et les billes de protéine A/G agarose pendant 3 h à 4 °C. Les billes ont été retirées après centrifugation (3500 x g pendant 5 min) et lavées avec un tampon de lyse IP 500 mM (Tris-HCl 20 mM, pH 7, 4; NaCl 500 mM; EDTA 1 mM; et 1% NP-40) trois fois. Les billes ont ensuite été chauffées à 95 ° C avec un tampon de chargement SDS pendant 15 min, et séparées par SDS – PAGE pour Western blot comme décrit précédemment.

Pour l'analyse différentielle de l'expression génique parmi les différents groupes, l'ARNm total a été extrait et des bibliothèques d'ADNc ont été construites par transcription inverse. Les bibliothèques à extrémité unique ont été séquencées à l'aide d'un BGISEQ 500 (MGI Tech; Shenzhen, Chine). Les lectures ont été cartographiées sur les génomes de référence Ensembl souris (mm10/GRCm38)/-humain (hg38/GRCh38) à l'aide du logiciel HISAT2 (version 2.1.0). Les fichiers Binary Alignment Map (BAM) ont été générés via SAMtools (version 1.4) et les fragments par kilobase de modèle d'exon par million de valeurs de fragments cartographiés (FPKM) des gènes ont été calculés à l'aide de StringTie (version 1.3.3b) ; DESeq2 (version 1.2.10) a été utilisé pour l'analyse différentielle de l'expression génique. Les gènes avec un changement de pli> 1, 5 et les valeurs P ajustées correspondantes <0, 05 ont été identifiés comme DEG.

Nous avons utilisé l'algorithme de distance moyenne non pondérée pour générer un arbre de regroupement pour l'analyse de regroupement hiérarchique. Les niveaux d'expression génique de chaque réplique biologique ont été normalisés à l'aide de la méthode z-score.

Chaque voie KEGG ou terme de processus biologique GO et les gènes impliqués ont été définis comme un ensemble de gènes, et une liste classée et un type de permutation "" ensemble de gènes "" ont été générés à l'aide de la métrique "" Signal2Noise "" pour implémenter GSEA à l'aide de Java GSEA ( version 3.0).

Nous avons effectué une analyse d'enrichissement de la voie KEGG à l'aide du test exact de Fisher avec notre script R interne et téléchargé les annotations de la voie KEGG à partir de la base de données KEGG. Dans le même temps, les voies avec une valeur P <0, 05 ont été définies comme des voies significativement enrichies.

Nous avons décrit LAPTM5 et ses protéines en interaction qui ont été immunoprécipitées dans le test IP. Les protéines ont été soumises à une analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Les normes de sélection des molécules candidates étaient les suivantes : (1) les candidats doivent être présents dans le groupe traité par PAOA mais diminués dans le groupe traité par BSA : (2) le nombre de peptides uniques doit être >2.

Toutes les données ont été analysées par des méthodes statistiques correspondantes à l'aide du logiciel SPSS 21.0. Les différences entre deux groupes avec une distribution normale ont été déterminées à l'aide du test t de Student. Pour les comparaisons entre trois groupes ou plus avec une distribution normale, une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc Bonferroni (pour les données montrant l'homogénéité de la variance) ou du test post hoc Tamhane T2 (pour les données hétéroscédastiques) a été appliquée. Lorsque les données rencontraient une distribution non normale, un test statistique non paramétrique de Kruskal-Wallis était utilisé. La signification statistique a été fixée à P < 0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, et les méthodes statistiques utilisées avec les valeurs P correspondantes pour les données sont mentionnées dans chaque légende de figure. Nous avons recueilli les données des études animales en aveugle et aucune donnée n'a été exclue de l'analyse statistique finale.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données RNA-seq générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (SRA) sous le code d'accession PRJNA918313 (ID 918313 - BioProject - NCBI (nih.gov)) et PRJNA918311 (ID 918311 - BioProject - NCBI (nih.gov)). Données traitées d'ARN-seq de foies humains de patients cliniques NASH et de patients en bonne santé ou obèses sains (numéros d'accès : GSE66676, GSE63067, GSE61260, GSE48452, GSE162694_F4, GSE162694_F3, GSE162694_F2, GSE162694_F1, GSE162694_F0 , GSE130970), ARN-seq du foie des échantillons de souris NASH (numéros d'accès : GSE93819, GSE57290_68W, GSE57290_38W, GSE53381, GSE51432) ont été collectés à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO). Toutes les autres données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires et tableaux supplémentaires. Un résumé des rapports pour cet article est disponible sous forme de fichier d'informations supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions le Dr Hao Zhang (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology), Shan-Shan Chen (Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology) pour leur assistance technique et leur encouragement mental. . Ce travail a été soutenu par des subventions des Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (HUST n° 2021GCRC037) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81730015, 82170504, 81974048).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lang Jiang, Jing Zhao, Qin Yang, Mei Li.

Département de chirurgie cardiovasculaire, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 430022, Wuhan, Chine

Lang Jiang, Hao Liu, Xiaoyue Xiao, Peiwen Yang et Jiahong Xia

Département de cardiologie, Hôpital central de Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 430014, Wuhan, Chine

Jing Zhao, Manhua Chen et Ping Ye

Département de cardiologie, Hôpital central de Huanggang, 438021, Huanggang, Chine

Qi Yang

École des sciences médicales fondamentales, Université de Wuhan, 430071, Wuhan, Chine

Mei Li, Song Tian et Sha Hu

Département de cardiologie, Hôpital Renmin de l'Université de Wuhan, 430060, Wuhan, Chine

Zhen Liu

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P.Ye. et JX a conçu les expériences. LJ, JZ, QY et ML ont réalisé les expériences, l'analyse des données et rédigé le manuscrit. ST, SH et ZL ont effectué une analyse bioinformatique. HL, XX et P.Yang. fourni un support technique. MC a fourni des conseils et des commentaires. P.Ye., MC et JX ont organisé et supervisé l'étude.

Correspondance à Manhua Chen, Ping Ye ou Jiahong Xia.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Pablo Muriel et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Jiang, L., Zhao, J., Yang, Q. et al. La protéine transmembranaire associée au lysosomal 5 améliore la stéatohépatite non alcoolique en favorisant la dégradation du CDC42 chez la souris. Nat Commun 14, 2654 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

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Reçu : 14 septembre 2022

Accepté : 05 avril 2023

Publié: 08 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

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